GC-MS法分析粗齿冷水花石油醚部位的脂溶性成分

[目的]研究粗齿冷水花石油醚部位中的脂溶性成分.[方法]采用硅胶柱层析分离粗齿冷水花石油醚部位脂溶性的化学成分,甲酯化后利用气相-质谱方法对其进行分析.结果：分离出25个成分,并鉴定出其中14个成分,主要成分为7,11-二甲基-3-亚甲基-（E）-1,6,10-十二碳三烯（23.750％）、1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-1,8a-二甲基-7-（1-甲基乙烯基）-[1S-（1α,7α.,8aα）]-萘（15.541％）、1-甲基-4-（5-甲基-1-亚甲基-4-己烯基）-（S）-环己烯（30.349％）和角鲨烯（11.485％）.[结论]这些成分均首次从粗齿冷水花中分离鉴定,为充分开发和利用该药材资源提供科学依据.     

番茄育种种质对南方根结线虫抗性评价及Mi-1基因检测

本研究以自育的26份番茄育种种质和抗南方根结线虫番茄品种‘仙客1号’及感南方根结线虫品种‘阿乃兹’为试验材料,采用病土盘栽自然发病鉴定、苗期二龄幼虫人工接种鉴定和PCR扩增及CAPS检测相结合的方法,研究供试材料对南方根结线虫的抗性水平及基因型。鉴定结果表明,供试的28份番茄材料中,高抗17份、抗病6份(包括抗病对照‘仙客1号’)、感病2份、高感3份(包括感病对照‘阿乃兹’),无免疫材料,且病土盘栽鉴定与苗期接种鉴定的结果一致。PCR扩增结果表明,27份番茄材料均能检测到一条750 bp的特异条带;TaqⅠ酶切结果显示,具有酶切位点的22份试材中有15份含纯合显性Mi-1/Mi-1基因、5份含杂合显性Mi-1/mi-1基因、2份含180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段,并且这22份试材对南方根结线虫表现高抗或抗,而其余5份不含显性Mi-1基因的试材则表现高感或感,证明Mi-1是具有抗南方根结线虫能力的基因,分子检测结果与病土盘栽鉴定和苗期接种鉴定的结果吻合率达92.6%;含有180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段的高抗材料可能含有其它抗根结线虫基因。分子检测与抗性鉴定相结合,能为创制抗南方根结线虫新种质提供一种更加省时、省力且经济有效的科学育种方法,可为番茄抗南方根结线虫育种提供理论依据和实践经验。     

酸枣组培快繁研究

以休眠芽为试材,建立了酸枣的组培快繁体系。最适启动培养基为MS+BA1 0+IBA0 1或MS+BA2 0+NAA0 1,增殖培养基为MS+BA2 0～3 0,萌芽率和壮芽率均超过了70%。增殖培养时,下部茎段的出芽率高于上部茎段,但萌发壮芽的比率则以上部茎段相对较高。1 2MS+IBA0 5～1 0是酸枣快繁生根培养的适宜培养基,生根率最高可达92%。     

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

2018年中国部分地区猪瘟病毒2.1d亚型新流行株的基因组特征分析

为了解中国猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的分子流行病学及遗传变异情况，本研究应用RT-PCR方法对2018年采集自河南、河北、山东、黑龙江和辽宁5个省份的350份疑似CSFV感染的病料进行E2和NS5B基因扩增，并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示，350份样品中21份为CSFV阳性，共获得14株CSFV的E2基因序列和7株CSFV的部分NS5B基因序列。E2全基因、NS5B部分基因序列分析表明，21份阳性样品均属于近年来在中国流行的CSFV 2.1d亚型，且新发现的2.1d亚型CSFV与中国较早2.1d亚型CSFV毒株间同源性差异不大，新发现的2.1d亚型CSFV分离株在E2基因的6个氨基酸（R³¹、S³⁴、W¹⁸²、K²⁰⁵、K³⁰³、A³³¹）上具有相同的分子特征，E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异。韩国2.1d亚型CSFV在E2蛋白上具有3个独特的氨基酸（N⁹⁷、K¹⁵⁹、R²⁰⁵）特征，并且发现了韩国毒株YC11WB可能作为2.1b和2.1d亚型CSFV过渡毒株的证据，流行于中国和韩国的2.1d亚型CSFV可能分别来自于本国早期2.1b亚型CSFV的衍化。本研究证实，2018年中国及周边国家CSFV较为活跃，且流行毒株依然以2.1d亚型为主，为中国科学防控CSFV提供了依据。     

microRNA-124-3p调控H1N1亚型猪流感病毒致小鼠肺损伤的研究

为研究microRNA-124-3p（miR-124-3p）对H1N1亚型猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）感染小鼠所致肺损伤的调控作用，本试验构建miR-124-3p腺病毒表达载体，通过小鼠尾部静脉注射法构建miR-124-3p差异表达小鼠模型，试验分3组：过表达组、抑制组和对照组。48 h后，各组小鼠鼻腔接种H1N1亚型SIV，每只10⁵ EID₅₀（50 μL）。连续观察14 d，计算小鼠平均体重变化率、观察病理切片并测定相关炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达量。结果显示，已成功将pre-miR序列及其sponge序列插入腺病毒的穿梭质粒，并将其共转染293A细胞。实时荧光定量PCR检测证实，与对照组相比，过表达组和抑制组小鼠黑色素瘤细胞miR-124-3p表达水平分别极显著升高（P<0.01）和显著降低（P<0.05），表明成功构建腺病毒表达载体。过表达组、抑制组和对照组小鼠体重变化率分别为－5.5%、－12.4%和－8.6%。抑制组和对照组均可见肺泡壁增厚，其间有多量淋巴细胞浸润，部分肺泡内出现纤维蛋白渗出，且抑制组病理变化更为严重，肺泡中还有大量的红细胞浸润；而过表达组仅有少量的淋巴细胞浸润，肺脏组织较正常。与对照组相比，过表达组检测的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）；抑制组炎症相关炎症因子mRNA表达水平均显著升高（P<0.05）。本试验结果表明，miR-124-3p对H1N1亚型SIV感染小鼠所致的肺脏炎症因子的表达具有抑制作用，同时能减轻肺脏病理损伤。     

传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gJ基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列（NC006233）设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析酣蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa-483aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a（＋）中,转化BL21（DE3）菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65．2ku的重组蛋白,命名为卜出,表达量占菌体蛋白总量的60．8％;Westernblot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。     

H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10^2.63 TCID₅₀/100 μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰ H₂O₂的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50 μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（CSFV）阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1：3 200的HI=2^-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。     

鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)的灭活试验

为了研究鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)中两种病毒的最佳甲醛灭活浓度和灭活时间,试验选取四种甲醛最终浓度0.1%、0.2%、0.4%、0.8%,分别对两种抗原进行灭活,在灭活10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h、30 h、36h、42 h分别取样,对每个样品进行灭活检验和血凝价测定。从试验结果得出,新城疫病毒(La Sota株)最适合的甲醛浓度为0.1%,灭活时间为16 h;禽流感病毒(H9亚型HP株)最适合甲醛浓度为0.1%,灭活时间为18 h。     

不同品种兔眼越橘花粉超微结构与营养成分的观察分析

为探索越橘花粉稔性与超微结构及营养成分的关系,以灿烂、园蓝、粉蓝、杰兔和顶峰5个兔眼越橘品种的花粉为试材,运用透射电镜观察花粉结构及测定了花粉营养成分。结果表明,越橘花粉结构中,内膜系统清晰可见,发育程度因品种而异。花前的花粉细胞核仁较大,蛋白质合成旺盛。通过花粉超微结构与营养成分间关系的分析比较表明,花粉壁的厚度、花粉细胞的蛋白质含量与花粉的萌发率没有相关性。花粉细胞的全糖和脯氨酸含量与花粉发芽率有正相关趋势。内质网发育程度与蛋白质含量呈正相关趋势。